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May 27, 2023

白点症候群ウイルス（WSSV）は白エビの脂質代謝を調節する

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 6、記事番号: 546 (2023) この記事を引用

477 アクセス

5 オルトメトリック

メトリクスの詳細

WSSVに感染したエビにおけるエネルギーと生合成の構成要素の利用可能性を高めるヴァールブルグ効果に加えて、WSSVはウイルスゲノム複製段階（12 hpi）でウイルス複製のための物質とエネルギーを提供する脂肪分解と、脂質生成の両方を誘導します。ウイルスの後期段階（24 hpi）で、特定の種の長鎖脂肪酸（LCFA）を供給することによってウイルスの形態形成を完了します。 今回我々はさらに、WSSVがウイルスゲノム複製段階で血球の脂肪滴（LD）の減少を引き起こし、ウイルス後期段階でWSSVに感染した血球の核でLDの増加を引き起こすことを示す。 肝膵臓では、WSSV 感染によって脂肪分解が引き起こされ、これにより脂肪酸が血リンパに放出されます。 β酸化阻害実験により、WSSVによる脂肪分解によって生成された脂肪酸がエネルギー生産のためのβ酸化に転用できることが明らかになりました。 ウイルスの後期段階では、WSSV感染により胃と肝膵臓の両方で脂質生成が引き起こされ、この段階ではビリオンの形態形成のために脂肪酸の需要が高いことが示唆されています。 我々の結果は、WSSVが脂質代謝をさまざまな段階で特異的に調節し、その複製を促進することを示しています。

代謝の再プログラミングを誘導することにより、がん細胞は代謝中間体とエネルギーの需要を満たすことができます1、2、3。 その後、がん細胞の急速な成長と増殖を促進するために、核酸、タンパク質、脂質などの生体分子が生成されます4。 この代謝再プログラミングの重要な部分は、多くの異なる種類の癌細胞で観察される脂質代謝の変化です5、6。 脂質は多用途であり、がん細胞内ではいくつかの役割を果たすことができます。 したがって、たとえば、がん細胞内の脂肪酸（FA）は、がん細胞の増殖中に生体膜を構築するために使用できます7、8。 脂肪酸酸化 (FAO) に関与する酵素も、エネルギーと NADPH の生成に対応するためにがん細胞で過剰発現されることがよくあります 9,10。 脂質部分によるタンパク質の修飾も癌の代謝と関連しています 11,12。

脂質はがん細胞の多くの生物学的プロセスに深く関与しているため、侵入から放出に至るまでのウイルス複製のさまざまなメカニズムにも関与しています 13,14。 脂質代謝の再プログラミングは、ヴァールブルク効果を引き起こすいくつかのウイルス、すなわちカポジ肉腫ヘルペスウイルス (KSHV) 15、C 型肝炎ウイルス (HCV) 16、およびヒトパピローマウイルス (HPV) 17 で発見されています。 デング熱ウイルス (DENV) は、宿主の脂質プロファイルを変化させることによって膜変化を誘導し、それによってウイルスの複製を促進し、ウイルスを抗ウイルス防御機構から保護します 18。 DENV はまた、脂肪滴タンパク質 AUP1 を利用してリポファジーを開始し、これによりウイルスの複製を促進するリン脂質が生成されます 19。 KSHV 外皮タンパク質は宿主細胞膜の脂質ラフトを標的にしてウイルス粒子の放出を促進します 20 が、NS5A と呼ばれる HCV 由来のタンパク質は脂肪滴のサイズの増加に寄与し、HCV の形態形成プロセスを促進します 21。 一方、エンベロープを持ったウイルスでは、宿主細胞膜の脂質がウイルスの外皮として使用されるのが一般的です22。 これらの例はすべて、感染性ビリオン粒子の産生を促進するために、ウイルスによる脂質代謝の修飾または変化がどのように必要であるかを示しています。

他のウイルスと同様に、白点症候群ウイルス (WSSV) と呼ばれる致死性のエビウイルスは、感染中にさまざまな脂肪酸種の集団と組成を変化させることが示されています。ウイルスゲノム複製段階 (12 hpi) で、WSSV は脂肪分解を誘導し、この段階では、脂肪酸がβ酸化を受けてエネルギーと生体分子が生成されますが、後期（24 hpi）では、WSSV が脂肪酸合成酵素（FAS）の発現を増強して脂質生成をサポートし、その結果、大量の脂肪酸が生成されます。ビリオンの形態形成について 23. 本研究では、WSSVに感染したエビにおけるこれらの脂質代謝変化の背後にあるメカニズムをさらに調査します。 まず、蛍光染色を使用して、ウイルス複製のさまざまな段階における感染血球内の脂肪滴の局在を調査します。 次に、脂肪分解における重要な酵素であるリパーゼの活性を測定し、エビ組織中の脂肪酸の量に対するその影響を監視します。 β酸化がエネルギー産生とビリオンの形態形成にどのような影響を与えるかを調べるために、CPT1阻害剤であるエトモキシルを使用して、WSSVに感染したエビのβ酸化をブロックしました。 最後に、感染したエビのβ酸化と脂肪酸合成の両方をブロックし、これがエビの組織内の長鎖脂肪酸（LCFA）の種類にどのような影響を与えるかを観察しました。

我々は以前、WSSV が感染中に長鎖脂肪酸の種類を変化させることを示しました 23。 ここでは、WSSV に感染したエビにおける脂質蓄積の動態をさらに理解するために、BODIPY 493/503 染色を使用して、12 および 24 hpi の両方での脂肪滴の数、その細胞分布、および液滴サイズの変化をモニタリングしました (図.1a)。 ウイルスゲノム複製段階（12 hpi）では、WSSV感染グループではPBSコントロールと比較して脂肪滴（LD）を含む細胞が少なく（図1bi）、この段階で脂肪分解が発生していることが示唆されました。 逆に、ウイルス後期（24 hpi）では、LD を有する血球の数が WSSV 感染グループで大幅に増加し、LD を有する各血球にはより多くの LD 点も含まれていました（図 1bi、ii）。 WSSVは、どちらの段階でも細胞質LDを有する血球の数に影響を与えませんでしたが（図1biii）、後期段階では、WSSVに感染したエビの核内にLDを有する血球がより多くなりました（図1biv）。 WSSV はまた、後期段階で細胞質および核の両方の LD の数を増加させました (図 1bv、vi)。 WSSV感染グループの血球におけるLD数の増加は、WSSVが後期段階で脂肪生成を引き起こす可能性を示唆した。

a 12 hpi および 24 hpi で WSSV 感染エビおよび PBS 注射エビ (コントロール) から収集した血球を、それぞれ核、細胞質、および脂肪滴 (LD) を視覚化するために DAPI、エバンスブルー、および BODIPY で染色しました。 スケールバーは 10 μm を表します。 b LD を定量化するためにさまざまな指標が使用されました。 [i] LD が検出された細胞の割合。 [ii] LD を含む細胞あたりの LD 点の数。 [iii] LD を有する細胞全体に対する細胞質 LD を有する細胞の割合。 [iv] 核 LD を有する細胞の割合/LD を有する全細胞の割合。 LD 保有血球あたり [v] 細胞質および [vi] 核に存在する LD 点の数。 [vii] 細胞質および [viii] 核の最大 LD 直径。 [ix] 細胞質および [x] 核内の LD 陽性領域。 結果は、特定の分母細胞タイプ (n > 100) の総数に対する透過化された細胞の割合の平均 (n > 3) として表されました。 各バーは平均値 ± SD を表します。 アスタリスクは、WSSV グループと PBS グループ間の差異を示します (*p < 0.05、**p < 0.01)。

WSSVグループでは、細胞質LDの直径と総断面積はウイルスゲノム複製段階で有意に増加し、ウイルス後期段階で減少しました（図1bvii、ix）。 しかし、これらの変化は核LDでは観察されませんでした（図1bviii、x）。

我々は、WSSV に感染したエビの 3 つの異なる組織におけるリパーゼ活性を調べました。 ウイルスゲノム複製段階では、血球や胃ではPBS群とWSSV群の間でリパーゼ活性の差異は観察されなかったが、WSSV感染肝膵臓ではリパーゼ活性が上昇した（図2a）。 後期段階では、すべてのWSSV感染組織でリパーゼ活性は変化しませんでした（図2b）。 リパーゼ活性によって産生されるFFAも、ウイルスゲノム複製段階のWSSV感染血球および血リンパにおいてより高いレベルで検出された（図2c）。 これは、肝膵臓におけるリパーゼ活性の上昇によるものである可能性があります。 逆に、WSSVに感染した肝膵臓ではウイルス後期段階でFFAが大幅に減少しました（図2c）。これはウイルスゲノム複製段階での脂質枯渇の結果である可能性があります。

PBS 注射および WSSV 注射されたエビの示された組織を 12 hpi および 24 hpi で収集し、a、b リパーゼ活性測定、および (c) 遊離脂肪酸の定量に供しました。 リパーゼ活性は、感染した肝膵臓において 12 hpi で増加しました。 遊離脂肪酸は、12 hpi で血球および血リンパで増加しましたが、感染肝膵臓では 24 hpi で遊離脂肪酸の有意な減少が見つかりました。 各バーは平均 ± SD、n = 2 ～ 3 プール サンプル (プールあたり 3 匹のエビ) を表します。 アスタリスクは、WSSV グループと PBS グループ間の差異を示します (*p < 0.05、**p < 0.01)。 Hcy 血球、Hly 血リンパ、Stm 胃、Hep 肝膵臓。

通常の状況下では、脂肪滴とトリグリセリドはリパーゼの基質であり、これらは FFA に分解され、その後ミトコンドリアに輸送され、β 酸化によるエネルギー生成に使用されます 24,25。 ここでは、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ I (CPT1) の特異的阻害剤であるエトモキシルでエビを処理して、LCFA のミトコンドリアへの侵入をブロックし、β 酸化を阻害しました。 β酸化が阻害されると、WSSVに感染した血球のミトコンドリア活性（ATP/ADP比で表される）がウイルスゲノム複製段階では大幅に減少するが、後期段階では増加することがわかりました（図3a）。 β酸化もビリオン生成に重要であるかどうかを判断するために、次に血球と血リンパのウイルスゲノムのコピー数を測定しました。 血球では、溶媒グループのウイルスゲノムコピー数は、ウイルスゲノム複製段階と比較してウイルス後期段階で増加しましたが、β酸化を阻害すると後期段階でのウイルスゲノムコピー数がさらに高くなりました（図3b）。 同様に、血リンパでも、β酸化を阻害すると、後期段階でウイルスゲノムのコピー数が大幅に増加しました（図S1）。 これらの結果は、β酸化の阻害が血球と体リンパの両方で一貫してウイルスゲノムDNAの増加につながることを示し、β酸化がWSSV複製に関与している可能性があることを示唆しています。

WSSV攻撃の10時間後にエビにエトモキシルを注射した。 a 12 hpi および 24 hpi の血球を ATP/ADP 比アッセイに供しました。 アスタリスクは、WSSV グループと PBS グループ間の差異を示します (*p < 0.05、**p < 0.01)。 b WSSV攻撃後の両方の時点の血球を使用してウイルスゲノムのコピー数を定量し、ウイルスDNA複製を評価しました。 各バーは平均 ± SD、n = 3 ～ 4 のプールサンプル (プールあたり 4 匹のエビ) を表します。 アスタリスクは、WSSV グループ間の差異を示します (*p < 0.05、**p < 0.01)。 解決。 溶媒、Eto エトモキシル、Hcy 血球。

リパーゼはウイルスゲノム複製段階で肝膵臓で活性化され（図2a）、我々はリパーゼ活性によって生成されたLCFAがβ酸化に移行するのではないかという仮説を立てた。 これは、同じ段階で感染した胃ではさまざまな LCFA が減少すると報告した Hsieh ら 23 とも一致します。 したがって、我々は、β酸化阻害条件下で肝膵臓内のさまざまな LCFA の量を定量することに進みました。 ウイルスゲノム複製段階では、動物に見られる最も一般的な飽和脂肪酸の 1 つであるパルミチン酸 (C16:0) が、PBS 対照 (PBS/PBS グループ) と比較して、WSSV 感染 (WSSV/PBS グループ) によって大幅に減少しました。しかし、β酸化がブロックされると有意に増加しました（WSSV/Etoグループ）（図4a）。 同様の結果は、C18:0、C20:1、C20:2などの他のLCFAでも観察され（図4a）、予想通り、β酸化のブロックによりWSSVによって誘導されるLCFAのさらなる代謝プロセシングが妨げられたことが示唆されました。 ウイルス後期では、脂肪分解がもはや活性化されなくなり(Hsieh et al.23)、β酸化の阻害は有意な効果を示さなかった(図4b)。 これは、β酸化によって生成されるエネルギーはこの段階では必要ないという考えと一致しています（図3a）。

肝膵臓サンプルは、WSSV 感染グループと PBS 対照グループから 12 および 24 hpi に収集されました。 WSSV感染群は、WSSV感染エビがPBSまたはエトモキシルのどちらで処理されたかに応じて、WSSV/PBSおよびWSSV/Etoとして指定された。 同様に、PBS 対照グループを PBS/PBS および PBS/Eto と名付けました。 a 12 hpi および b 24 hpi からの LCFA プロファイルは、ガスクロマトグラフィー質量分析 (GC/MS) によって決定されました。 β-酸化阻害により、12 hpi で WSSV 誘発の LCFA 消費が中断されました。 各バーは平均±SD、n = 2 プールサンプル (プールあたり 3 匹のエビ) を表します。 アスタリスクは、WSSV グループと PBS グループ間の差異を示します (*p < 0.05、**p < 0.01)。

Hsieh et al.23 は、WSSV 複製における FAS の関与を実証しました。 1. FAS 発現は、PI3K-Akt-mTOR-HIF1α シグナル伝達経路を介して WSSV によって誘導されました。 2. FAS はビリオンの形態形成に重要でした。 LCFA 生成における FAS の役割を特徴付けるために、WSSV 注射の 4 時間後に、ウイルス攻撃したエビに FAS 阻害剤 C75 を筋肉注射し、その後胃と肝膵臓で LCFA を定量しました。 ウイルスゲノム複製段階の胃では、WSSV感染によりさまざまなLCFAが減少した（WSSV/PBS群）。 しかし、少数のLCFAを除いて、FASも阻害された場合(WSSV/C75グループ)、これらの減少の大きさは減少した(図5a)。 後期段階では、C16:0、C18:1n-9c、C18:1n-9t、および C20:5n-3 を含むいくつかの LCFA が WSSV 感染 (WSSV/PBS グループ) によって増加し、脂質生成が誘導されたことが示唆されました (図5b)。 しかし、FAS阻害により、WSSV感染エビ(WSSV/C75グループ)におけるLCFAの生成が妨害された(図5b)。

WSSV注射の4時間後にC75をエビに注射してFASを阻害した。 WSSV感染群は、WSSV感染エビにPBSまたはC75が注射されたことを示すために、WSSV/PBSおよびWSSV/C75と名付けた。 PBS 対照群は PBS/PBS および PBS/C75 と名付けられました。 ガスクロマトグラフィー質量分析 (GC/MS) を使用して、12 hpi および b 24 hpi での WSSV 感染胃の LCFA プロファイルを調査しました。 FAS 阻害により、感染後期における LCFA の産生が減少しました。 各バーは平均 ± SD を表します。n = 2 ～ 4 のプールサンプル (プールあたり 3 匹のエビ)。 アスタリスクは、WSSV グループと PBS グループ間の差異を示します (*p < 0.05、**p < 0.01)。

図6aに示すように、WSSVはウイルスゲノム複製段階で感染肝膵臓のパルミチン酸とステアリン酸（C18:0）も減少させました（WSSV/PBSグループ）が、この減少はFAS阻害によってキャンセルされました（WSSV/C75グループ） ）。 後期段階では、感染肝膵臓ではさまざまなLCFAが増加しましたが（WSSV / PBSグループ）、FAS阻害には有意な効果はありませんでした（WSSV / C75グループ）（図6b）。 これらの結果は、脂肪分解がウイルスゲノム複製段階で引き起こされ、脂肪生成が後期段階で引き起こされるとするHsiehらの報告23と一致しており、総合すると、WSSVがWSSV感染エビの脂質代謝の経路を変更することが確認されている。

ガスクロマトグラフィー質量分析 (GC/MS) を使用して、12 hpi および b 24 hpi での FAS 阻害 WSSV 感染肝膵臓を調査しました。 WSSV感染群は、WSSV感染エビにPBSまたはC75が注射されたことを示すために、WSSV/PBSおよびWSSV/C75と名付けた。 PBS 対照群は PBS/PBS および PBS/C75 と名付けられました。 胃とは異なり（図５ｂ）、ＦＡＳ阻害は、後期段階の肝膵臓におけるＬＣＦＡ産生に影響を及ぼさなかった。 各バーは平均 ± SD を表します。n = 2 ～ 4 のプールサンプル (プールあたり 3 匹のエビ)。 アスタリスクは、WSSV グループと PBS グループ間の差異を示します (*p < 0.05、**p < 0.01)。

脂質代謝の再プログラミングは、がん細胞や脊椎動物ウイルスに感染した細胞 26、27、28 だけでなく、ウイルスに感染した無脊椎動物細胞にも見られます 18。 結合していない脂肪酸に関する新たなデータを含む今回の結果は、WSSVに感染したエビの脂質代謝がどのように経路変更されるのかについてさらなる詳細を提供することになる。 以前の研究 23 では、脂肪分解はウイルスゲノム複製段階で誘導されるのに対し、脂質生成はウイルス複製の後期段階で誘導されることを発見し、これらの代謝シフトは LCFA プロファイルの変化によって特徴付けられ、いくつかの LCFA が減少することも報告されています。ウイルスゲノム複製段階。 我々の現在のLD染色結果はさらに、ウイルスゲノム複製段階でLD、特に細胞質LDが減少していることを示しており（図1bi、v）、この段階で脂肪分解が起こっているというさらなる証拠を提供している。 このプロセスによって放出されたFFAは、β酸化によるエネルギー生成源として機能します（図3a）。 脂肪酸は、デングウイルスに感染したヒト細胞株（DENV）でも同様の方法で使用され、LD がリソソームに輸送され、放出された脂肪酸がβ酸化を受けてウイルス複製のための ATP が生成されます 29。 β酸化とビリオンの形態形成との関係（図3bおよびS1）に関しては、β酸化を介した脂肪酸の消費により、ウイルスの後期段階で起こる脂質生成とビリオンの形態形成に必要な物質も生成されるという仮説を立てています。レプリケーション。 これを裏付けるために、WSSV ビリオンでは宿主細胞核と比較して炭化水素種とコレステロール種の数が多く 30、エンテロウイルスは脂肪分解を介して宿主脂肪酸をその複製コンパートメントに再分配する 31 ことに注目します。これらの観察はいずれも以下の結果と一致しています。消費された脂肪酸がコレステロールなどの特定の脂質の生産に再利用されるのではないかという考え。 ただし、β酸化阻害により血球内（図3b）と血リンパ内（図S1）の両方でウイルスDNAが増加したことにも注目します。これは、β酸化が本当にビリオンの形態形成を促進しているかどうかを説明するのは困難です。 。 一方、ビリオンのコピー数をカウントするための私たちの方法は、完全なビリオンと不完全なビリオンの両方を同様に良好に検出するため、β酸化阻害がビリオンの形態形成プロセスを混乱させ、大量の異常なビリオンを引き起こしている可能性もあります。および/または血リンパに放出される裸のウイルスDNA。 明らかに、これらの可能性は、同位体追跡などの技術を使用して実験的にさらに調査する必要があります。

HCV および SARS-CoV-232,33 に感染した細胞で観察される LD 蓄積は、ウイルス感染の後期段階で WSSV 感染血球でも観察され (図 1bi、ii)、Hsieh によって報告されている。他23． ここで、LD のほとんどは感染した血球の核に局在しており (図 1biv、vi)、そこでビリオンの形態形成が起こります 34,35。 ラマンイメージングでは、[60 hpiで]感染血球の核内の脂質含有量が著しく増加していることも示されました（図S2）。 現在までのところ、WSSV が血球核に局在する蓄積した LD をどのように利用するのかは不明であるが、C 型肝炎ウイルスの場合と同様に、WSSV がビリオンの形態形成に使用されるウイルス成分の貯蔵庫を提供する可能性があると推測されている。 HCV ヌクレオカプシド コアと調節タンパク質 NS5A は小胞体 (ER) から LD に移動し、その後ビリオン集合の部位として機能します 36。 さらに、脊椎動物細胞に蓄積された核 LD は、ウイルス後期段階でのウイルスの形態形成を促進する遺伝子発現の調節に関与している可能性があります 37。 したがって、WSSV 感染の過程で LD には 2 つの運命がある可能性があります。1. ウイルスのゲノム複製段階で、LD は分解されてエネルギーが生成され、場合によってはビリオンの形態形成のための材料が提供されます。 2. ウイルスの後期段階では、LD が核内に蓄積してビリオンの形態形成をサポートします。

絶対寄生虫であるウイルスは、複製のために細胞宿主からエネルギー（ATP の形で）を取得します 38。 図3aに示すATP/ADP比の結果は、WSSVが両方の段階で溶媒グループのATPを上昇させたことを示しています（12および24hpiでのPBS対照対WSSV）。 同様の結果が Apún-Molina et al.39 によって報告されており、WSSV に感染した肝膵臓では 24 hpi でより高いアデニルエネルギー電荷 (AEC) が観察されました。 この ATP 上昇は、WSSV がその複製を促進するためにエネルギーを必要とすることを発見した以前の研究と一致しています 39,40,41。 前に議論したように、β酸化はウイルスゲノム複製段階でウイルス複製のための ATP を提供している可能性があります。 しかし、驚くべきことに、24 hpiでは、β酸化阻害により、感染状態に関係なくATPレベルが上昇しました（図3a、24 hpiでの溶媒グループ対エトモキシルグループ）。 私たちは、β酸化阻害が長期間続いたことにより、細胞の生存能力を維持するために他のエネルギー経路が活性化されたのではないかと推測しています。

図 2a は、脂質を貯蔵する組織であるエビの肝膵臓でリパーゼ活性が誘発されたことを示しています。 Hsieh et al.23 が 12 hpi で胃内で減少し、24 hpi で増加することを発見した総脂肪酸とは異なり、ここで我々が発見したことは、FFA が 12 hpi で肝膵臓から血リンパおよび血リンパに放出された可能性があることを示唆しています。その後、血球に取り込まれます (図 2c)。 FA の取り込みは複製目的で他のウイルスによっても促進されることに注目します 42,43,44。 その後、ウイルス後期段階での肝膵臓におけるFFAの大幅な減少（図2c）は、肝膵臓がウイルス感染中にFAの供給源として機能する可能性があることを示唆しています。 さらに、WSSVに感染した肝膵臓ではウイルスゲノム複製段階でいくつかのLCFAが減少していることを観察しました（図4a）が、β酸化が阻害されると、このWSSV誘導性のLCFA消費は観察されなくなる（図4a）。 これらの結果は、肝膵臓に貯蔵されている脂質がウイルスゲノム複製段階で脂肪分解を介して分解され、このプロセスによって生成された脂肪酸がその後β酸化を受けるか、または直接血リンパに放出されてWSSV感染者のエネルギーを刺激することを示唆しています。血球。 逆に、ウイルスの後期段階では、β酸化の阻害はLCFAの利用可能性に大きな違いをもたらさなかった（図4b）。これは、Hsiehら23によって提案されているように、この時点でWSSV誘導性の脂質再プログラミングが行われていることを示唆している。脂肪分解から脂肪生成へと移行しました。

脂質生成における主要な酵素である FAS は、腫瘍細胞では増殖を維持するために活性化され、ウイルス感染細胞ではビリオンの形態形成のために活性化されます 45、46、47。 我々は以前、FAS 阻害はビリオンの形態形成を損なうが、ウイルスタンパク質の発現は損なわないことを発見した 23 。 ここで、WSSVに感染した血球のエネルギー状態がFAS阻害によって破壊されないことをさらに発見しました（図S3）。 これらすべての結果は、FAS がウイルスの形態形成にのみ使用される FA を生成することを示唆しています。 予想通り、ウイルスの後期段階では、FAS阻害は感染胃におけるWSSV誘導性脂肪生成を妨げた（図5b）。 しかし、この効果はオレイン酸（C18:1n-9c）を除いて肝膵臓では見られませんでした（図6b）。 驚くべきことに、FAS阻害は、WSSVに感染した胃と肝膵臓の両方において一部のLCFAの消費も遅らせた（図5aおよび6a）。

まとめると、これらの結果は、WSSVがどのように宿主の脂質代謝を調節して複製に好ましい環境を確立できるかを示している。WSSVは、ウイルスがFAをエネルギー源として使用しているかウイルスの形態形成の材料として使用しているかに応じて、脂肪分解または脂質生成のいずれかを引き起こす。 これは、一部のフラビウイルスで見られるのと同じ種類の脂質再プログラミングです48、49、50。 効果的な抗ウイルス戦略を開発するには、これらのメカニズムをサポートするシグナル伝達経路とウイルスタンパク質をさらに解明することが重要です。 我々は以前、WSSVがPI3K-Akt-mTOR-HIF1α経路を介してFAS発現を誘導することを示しましたが23、他のシグナル伝達経路も関与している可能性があります。 また、WSSV が感染後の特定の時点で脂肪分解から脂肪生成への切り替えをどのように制御できるかを調査することも興味深いでしょう。

この研究で使用した白エビ（Litopenaeus vannamei、体重 3 g）は、国立台湾海洋大学水生動物センター、国立成功大学（NCKU）エビ水産養殖科学開発国際センター、および同学部から入手しました。国立屏東科学技術大学（NPUST）水産養殖学士。 エビは、実験前に 1 ～ 2 日間、滅菌海水 (30 ppt、25 ～ 27 °C) を含むタンク システムで養殖されました。 実験接種材料のウイルスストックは、WSSV 台湾分離株 (GenBank アクセッション番号 AF440570) に感染した瀕死の SPF (特定病原体を含まない) エビから血リンパを収集し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (137 mM NaCl、2.7 μm) で希釈することによって得られました。 mM KCl、10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4)。 ウイルスストックは-80℃で保存し、実験用接種材料はPBSで希釈（10-4）してストックから調製しました。 エビに、WSSV接種材料(100μl/エビ)を筋肉内注射することによってチャレンジした。 この攻撃力価により、WSSV 誘発累積死亡率は 72 hpi で 50% となりました。

ウイルス注射の 12 時間後および 24 時間後に、WSSV 注射群および PBS 注射群からの 3 ～ 6 匹のエビの体液を、等量の抗凝固剤溶液 (450 mM NaCl、10 mM KCl、10 mM EDTA、10 mM EDTA、10 mM EDTA) を用いて個別に収集しました。 mM トリス-HCl、pH 7.5)。 次いで、血球の各サンプルを、２×リーボビッツ１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１０％ＦＢＳ、１％グルコース、０．００５％ＮａＣｌ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１．２５ｇ／ｍｌを含む）を用いてカバーガラス上に二重に播種した。 mlファンギゾン）。 室温で 20 分間インキュベートした後、血球を PBS で 3 回洗浄し、次に作業濃度 0.1 mg/mL の BODIPY 493/503 (Invitrogen) とともに室温、暗所で 1 時間インキュベートして中性細胞を染色しました。脂肪滴。 次いで、血球をＰＢＳでさらに３回洗浄した後、氷上で４％ホルムアルデヒドで固定した。 次に、細胞を作業濃度 1.5 × 10-5 μg/ml の DAPI (4'-6-ジアミジノ-2-フェニルインドール 二塩酸塩; Vector Laboratories Inc.) で 3 分間染色し、核を対比染色しました。 ＰＢＳでさらに３回洗浄した後、血球をエバンスブルー（０．２μｇ／ｍｌ）とともに１分間インキュベートして、細胞質を対比染色した。 最後に、カバーガラス上の細胞を顕微鏡スライド上にマウントし、蛍光顕微鏡を使用して蛍光を調べました。

初代WSSV感染エビ血球のLDを上記のように染色した後、画像キャプチャとその後の分析のために各スライドからいくつかのフィールドをランダムに選択しました。 各エビについて、少なくとも 100 個の細胞が調査されました。 この研究では、エビの血球における脂肪滴の動態を評価するためにいくつかの指標が使用されました。(i) LD を含む細胞/総細胞数 (%)。 (ii) LD を有する細胞内の LD 点の数。 (iii)細胞質LDを有する細胞/LDを有する総細胞(%); (iv)核LDを有する細胞/LDを有する総細胞(%); (v) LD を含む細胞あたりの細胞質 LD 点の数。 （vi）LDを有する細胞当たりの核LD涙点の数。 (vii) 細胞質 LD の最大直径。 (viii) 核 LD の最大直径。 (ix) 細胞質内の LD の総断面積 (μm2)。 (x) 核内の LD の総断面積 (μm2)。 次に、データは以下に説明するように統計分析を受けました。

エビの血球、胃、および肝膵臓のプールされたサンプルを、WSSV 注射の 12 時間後および 24 時間後に収集し (エビ 3 匹/プールおよび 4 プール/グループ)、市販のキット (リパーゼ活性蛍光分析キット III; BioVision Inc) を使用してリパーゼ活性を測定しました。 。）。 サンプルを 100 μl (血球) または 200 μl (胃および肝膵臓) の氷冷リパーゼアッセイバッファーでホモジナイズし、遠心分離して細胞破片を除去しました。 得られた溶解物(50μl/ウェル)を96ウェルプレートに移し、50μlの反応混合物(48μlのアッセイ緩​​衝液および2μlのリパーゼ基質)を各ウェルに添加した。 37 °C で 30 分間インキュベートした後 (T1)、各サンプルの吸光度を Ex/Em = 529/600 nm で測定し、A1 値を取得しました。 さらに 30 分間インキュベートした後 (T2)、各サンプルの吸光度を再度測定して A2 値を取得しました。 0 ～ 100 pmol/ウェルの範囲の一連の濃度からメチルレゾルフィン標準曲線を作成し、吸光度の差 (A2 ～ A1) を対応するメチルレゾルフィンの量 (B 値) に変換するために使用しました。 リパーゼ活性は次のように計算されました: リパーゼ活性 (mU/mg) = ΔB/ (ΔT × mg)、ここで mg は各反応混合物中の組織サンプルの重量です。 結果として得られたデータは、次に説明するように統計分析に供されました。

遊離脂肪酸定量比色/蛍光分析キット (BioVision Inc.) を使用して、各エビサンプル中の非結合長鎖脂肪酸を検出しました。 血球および血リンパのサンプルとしては、エビの血リンパを採取し、遠心分離により血球を分離した。 血球、血リンパ、胃および肝膵臓のサンプルを 200 μl のクロロホルム-Triton X-100 (純粋なクロロホルム中 1% Triton X-100) でホモジナイズし、遠心分離 (13,000 × g で 10 分間) 後、有機相 (下相) を分離しました。各サンプルを収集し、溶液がなくなるまで 50 °C で風乾し、その後 30 分間真空乾燥しました。 次に、各サンプルからのペレット（乾燥脂質）を200μlの脂肪酸アッセイ緩​​衝液に溶解し、得られた溶液50μlを96ウェルプレート上のウェルに移した。 ACS試薬(2μl)を加え、混合物を37℃で30分間インキュベートした。 最後に、50 μl の反応混合物 (44 μl 脂肪酸アッセイバッファー、2 μl 脂肪酸プローブ、2 μl 酵素ミックス、および 2 μl エンハンサー) をウェルに添加し、混合物を暗所で 37 ℃でさらに 30 分間インキュベートしました。 ℃。 キャリブレーションには、メーカーの指示に従ってパルミチン酸サンプルとブランクを使用しました。 各サンプルの吸光度を Ex/Em = 535/590 nm で測定し、0 ～ 10 nmol の範囲の一連の濃度からパルミチン酸標準曲線を作成しました。 これを使用して、サンプルの読み取り値を各ウェル内の対応する FFA 量 (Fa) に変換しました。 次いで、ＦＦＡ濃度を以下のように計算した：脂肪酸濃度（ｎｍｏｌ／ｍｇ）＝Ｆａ／Ｓｍｇ ここで、Ｓｍｇは各反応混合物中のサンプルの組織重量である。 得られたデータは、以下に説明するように統計分析に供されました。

CPT1 阻害剤エトモキシル (2[6(4-クロロフェノキシ)ヘキシル]オキシラン-2-カルボキシレート、Tocris Bioscience) および FAS 阻害剤 C75 (4-メチレン-2-オクチル-5-オキソテトラヒドロフラン-3-カルボン酸、ENZO Life) の原液Sciences) はそれぞれ ddH2O と DMSO に溶解して調製されました。 使用前に、両方のストックを PBS で必要な濃度まで希釈しました。

ApoSENSOR ADP/ATP 比アッセイ キット (BioVision) を使用して、12 および 24 hpi に収集したプール血球 (4 ～ 5 プール、プールあたり 4 匹のエビ) の ATP/ADP 比を測定しました。 この手順は、Li et al.40 および Chen et al.41 からわずかに変更されました。 チャレンジされたエビから血リンパを収集した後、それをプールし、4℃、3000×gで10分間遠心分離し、得られた血球のペレットを50μlのヌクレオチド放出緩衝液に懸濁した。 次いで、この懸濁液を、96ウェルELISAプレート上の10μlのATPモニタリング酵素および90μlのヌクレオチド放出緩衝液を含むウェルに加えた。 バックグラウンド発光コントロールは、ATP モニタリング酵素とヌクレオチド放出バッファーのみを使用して調製されました。 血球の ATP レベルを測定するために、最初の測定は 2 分間のインキュベーション後にコントロール (データ A) とサンプル (データ B) に対して行われました。 血球の ADP レベルを測定するために、サンプルに対して 2 回目の測定を再度行いました (データ C)。 次いで、ADP変換酵素(1μl)をサンプルに添加し、最終測定(データD)を行った。 すべての測定はルミノメーターを使用して行われました。 ATP/ADP 比は、(データ B) − (データ A)/[(データ D − データ A) − (データ C − データ A)] として計算されました。

ビリオンの放出を調査するために、遠心分離によって血球を血リンパから分離しました。 DTAB/CTAB DNA抽出キット(GeneReach Biotechnology Corp.)を使用して、血球と血リンパの両方から全ゲノムDNAを抽出した。 WSSVゲノムのコピー数は、市販のリアルタイムPCRであるIQ RealTM WSSV定量システム(GeneReach Biotechnology Corp.)を用いて、製造業者の指示に従って定量した。

WSSV複製におけるβ酸化とLCFAの役割を調べるために、CPT1阻害剤エトモキシルとFAS阻害剤C75をそれぞれ使用しました。 CPT1阻害のために、WSSV攻撃の10時間後にエビにエトモキシル(62.5mg/gエビ)またはPBSビヒクル(対照)を筋肉内注射した。 肝膵臓のプールサンプル (4 ～ 5 のプールサンプル、プールあたり 3 匹のエビ) を 12 および 24 hpi に収集しました。 GC/MS ベースの脂肪酸プロファイリングを使用して、検出された各長鎖脂肪酸の動態をモニタリングしました。 FAS 阻害については、C75 処理の用量とタイミングを以前の研究から変更しました 23 。WSSV または PBS を注射した 4 時間後に、エビを FAS 阻害剤 C75 (30 μg/g エビ) で処理しました。 肝膵臓および胃のサンプル (4 ～ 5 個のプールされたサンプル、プールごとに 3 匹のエビ) を 12 および 24 hpi で収集し、GC/MS 分析に使用しました。

ガスクロマトグラフィー質量分析 (GC/MS) ベースのエビのリポドミクスは、Hsieh et al.23 によって記載された方法に基づいて実行されました。 つまり、C22:0 脂肪酸の内部対照を含むクロロホルム溶液を最初にエビの組織に添加し (サンプルあたり 10 ～ 30 mg)、次に 2:1 (v/v) でホモジナイズすることによって組織から脂肪酸を抽出しました。 ) クロロホルム/メタノール。 一晩振とうし、濾過により破片を除去した後、ロータリーエバポレーターを使用して液体画分を40℃で乾燥させた。 次に、各サンプルから得られたペレットを純粋なクロロホルムで再溶解し、10 ml 反応バイアルに移し、ロータリーエバポレーターを使用して再度乾燥させました。 乾燥サンプルをケン化/エステル化した後、5975C シングル四重極質量分析計 (Agilent、米国カリフォルニア州パロアルト) および Supelco SP-2380 キャピラリー カラムを備えた 7890A ガスクロマトグラフィー機を使用して GC/MS リポドミクス分析を行いました。 30 mx 内径 0.25 mm; Sigma Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス）（前述）23。 MSD Chemstation G1701EA E.02.02.1431 (Agilent Technologies, Inc., USA) を機器制御、データ取得、およびデータ分析に使用しました。 NIST 11 質量スペクトル ライブラリ (米国メリーランド州ゲーサーズバーグ) を、Sigma-Aldrich から購入した標準物質の保持時間とともに、FA メチル エステル (FAME) の同定を支援するために使用しました。 同定された脂肪酸は、C22:0 脂肪酸内部標準に対して定量され、組織 1 mg あたりの FA の量が計算されました。 得られたデータは、以下に説明するように統計分析に供されました。

データの計算とグラフは、それぞれ Microsoft Excel と Graphpad Prism 9 で実行されました。 対応する方法セクションで詳細に説明されているように、各実験で少なくとも 3 つの独立した反復から生データが収集されました。 統計的外れ値の検出と除外のためにすべてのデータに対して前述のとおり経験則 51 を実行した後、複数の治療法を比較するためのスチューデントの t 検定によってグループ間の統計的有意差を分析しました。 補足データ 1 で提供されるデータは、この研究で提示される図を生成するために使用されます。 データは平均値 ± SD として表示されます。 有意性は *p < 0.05、**p < 0.01 で示されます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で示されている主要な数値のソース データは補足データ 1 として提供されています。その他すべてのデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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リファレンスをダウンロードする

この研究は、台湾国家科学技術評議会 (MOST 106-2321-B-006-010、MOST 108-2314-B-006-096-MY3、MOST 110-2634-F-006-019 および NSTC 111) の資金提供を受けました。 -2628-B-006-017)。 また、この原稿に対する有益な批評をしてくださった国立成功大学の Paul Barlow 氏に心から感謝いたします。

台湾、台南、国立成功大学生物科学生物工学部生物工学生物産業科学科

イェン・ション・ン、チェン・シュン・チェン、イーティン・ツェン、シューティン・ヘ、チュンユアン・リー、シューウェン・チェン、イーミン・チェン、ラムヤ・クマール、ハン・チン・ワン

早稲田大学ナノ・ライフイノベーション研究機構、東京

Masahiro Ando & Haruko Takeyama

台湾、台南、国立成功大学、エビ養殖科学開発国際センター

Ramya Kumar & Han-Ching Wang

国立屏東科学技術大学水産養殖学部、屏東、台湾

リュー・チュンフン

早稲田大学生命医科学科

Haruko Takeyama

計算バイオビッグデータオープンイノベーション研究室 (CBBD-OIL)、産業技術総合研究所、東京

Haruko Takeyama

早稲田大学理工学研究所生命動態高等研究所、東京

Haruko Takeyama

東京海洋大学海洋生物科学科

Ikuo Hirono

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C.-SC、H.-CW、MA、Y.-MC、Y.-TT が研究を計画しました。 C.-SC、S.-TH、C.-YL、Y.-TT が実験を行いました。 C.-SC、S.-TH、C.-YL、YSN、および。 Y.-TT はデータを分析しました。 C.-HL、H.-CW、HT、IH、Y.-MC がリソースを提供しました。 C.-SC、RK、S.-WC、YSN が記事を執筆しました。 C.-HL、HT、IH、H.-CW、MA、Y.-MC がプロジェクトを監督しました。

ハン・チン・ワン氏への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Liu Haipeng、Claudio Mejía-Ruiz、Ilie Racotta に感謝します。 主な担当編集者: Gabriela da Silva Xavier、David Favero。 査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Ng、YS、Cheng、CS.、Ando、M. 他。 白点症候群ウイルス (WSSV) は、白エビの脂質代謝を調節します。 Commun Biol 6、546 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04924-w

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受信日: 2022 年 9 月 26 日

受理日: 2023 年 5 月 8 日

公開日: 2023 年 5 月 20 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04924-w

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