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Aug 21, 2023

ニームの葉の粉末 (Azadirachta indica) は、ナイル ティラピア (Oreochromis niloticus) の鉛毒性によって引き起こされる酸化ストレスと病理学的変化を軽減します。

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9170 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

この研究では、鉛汚染地域（マリオッテヤ運河：Pb = 0.6 ± 0.21 mg L−1）から採取した野生のナイルティラピアと、鉛に実験的に2週間暴露した後の養殖魚の水系鉛毒性の臨床症状と病理学的症状を調査しました。酢酸塩（5 ～ 10 mg L-1）の投与に加えて、鉛毒性の症状を緩和するニーム葉粉末（NLP）治療の有効性を評価しました。 合計 150 匹の魚 (20 ± 2 g) を 5 つのグループに分けました (30 匹の魚/グループ、3 つの反復)。 G1 は、何の処理も行わずに陰性対照として割り当てられました。 グループ（2～5）は、5 mg L-1（G2 および G3）または 10 mg L-1（G4 および G5）の濃度の酢酸鉛に 2 週間曝露されました。 鉛曝露期間中、すべてのグループは同じ条件下で飼育され、G3 と G5 は 1 g L-1 NLP で処理されました。 野生ティラピア、G2、および G4 では、鉛の毒性により DNA 断片化と脂質過酸化が誘発され、グルタチオンのレベルとヘム合成酵素デルタアミノレブリン酸デヒドラターゼ (ALA-D) の発現が減少しました。 NLP は、G3 では鉛によって刺激された酸化ストレスを軽減できましたが、G5 ではわずかな効果を示しました。 えらの上皮過形成、えらおよび筋肉の浮腫、肝臓および筋肉の変性および壊死、およびすべての臓器における白血球浸潤を含む病理学的所見は、鉛濃度と直接相関していた。 したがって、1 g L-1 の NLP の水性適用は酸化ストレスを軽減し、鉛毒性によって引き起こされる病理学的変化を軽減しました。

水産養殖は、乱獲された資源や絶滅危惧種の魚種を代替および保護するだけでなく、生産と人間の需要との間のギャップを埋めるための実用的な方法であると考えられています1、2、3。 1970 年代以来、水産養殖により魚介類の生産量は大幅に増加しましたが、この業界には依然としていくつかの課題があります。 水生環境、栄養、養殖魚など、相互に関連するさまざまな要因が、水産養殖事業の効率的な運営に影響を与えます。 持続可能な水産養殖は、これらの変数を最大化することに基づいて構築されます4。 水産養殖の有効性を高め、環境ストレス要因を軽減するための持続可能で環境に優しい技術の採用が、最近注目を集めています5。

非常に長い間、成長、発達、免疫力を高め、感染症を治療するための最良の方法は、化学療法と抗生物質でした。 しかし、水産養殖における従来の化学療法の継続使用は、魚の自然免疫と生態系に対する多くの悪影響によって制約を受けました6,7。 水産養殖部門では環境に優しいアプローチが代替手段として利用可能になっています8,9,10,11。 外因性酵素、有益な微生物、および薬用植物は、水生生物の健康と生産のための理想的な戦略です12、13、14、15。 水生環境は多くの環境汚染物質の溜まり場です16、17、18。 鉛は、鉱業や工業プロセスなどのさまざまな発生源から水生生態系に侵入する非基本元素です19,20。 鉛は酸化還元不活性金属であり、水生生物の組織や器官に蓄積し、水や堆積物中に長期間残留する可能性があります21、22、23。 酸化ストレスは鉛刺激毒性の中心的なメカニズムです。 抗酸化システムの能力を超えて活性酸素種（ROS）の生成が増加すると、さまざまな臓器の細胞膜で脂質過酸化、タンパク質やDNAの酸化、酵素の失活、遺伝子発現の変化、細胞の酸化還元状態の変化が引き起こされます24,25。 魚の抗酸化システムの構造は、酵素と低分子量抗酸化物質で構成されています26。 スーパーオキシドジスムターゼ (SOD)、カタラーゼ (CAT)、グルタチオンペルオキシダーゼ (GPx)、およびグルタチオン-s-トランスフェラーゼ (GST) は主要な抗酸化酵素であり、酸化ストレスの重要なマーカーとして機能します 2,4,27。 さらに、グルタチオン (GSH) と酸化型グルタチオン ジスルフィド (GSSG) の減少は、非酵素的抗酸化防御において重要な機能を果たします 28。 鉛は、ヘモグロビン合成を阻害し、ヘム合成経路の必須酵素を制限することにより、造血系を改変します。 また、細胞膜の脆弱性を高めることにより、循環赤血球の寿命を短縮します29。 鉛はヘムの合成に必要な 3 つの主要な酵素をダウンレギュレートします。その中で最も顕著なものはデルタ アミノレブリン酸デヒドラターゼ (ALA-D) であり、ポルフォビリノーゲン シンターゼとしても同定されます。 ALA-D は、δ-アミノレブリン酸 (ALA) からポルホビリノーゲンを形成することによりヘム合成の第 2 段階を触媒するサイトゾル酵素です 30,31。 ALA-D はすべての組織で発現されますが、赤血球と肝臓の発現レベルが最も高くなります 32,33。 ALA-D 酵素の下方制御または不活性化は、鉛の毒性レベルを測定するために臨床的に使用されています 29、34、35。 水質汚染は魚の組織にさまざまな病理学的変化をもたらし、その重症度は水質汚染の程度と関連している可能性があります36,37。 最も影響を受ける2つの臓器は、水質汚染物質と直接接触するえらと、解毒に関与する肝臓です。 重金属の生体蓄積は他の臓器にも影響を与える可能性があります38、39、40。

ナイルティラピア (Oreochromis niloticus) は、エジプトで最も広く消費されている養殖淡水魚です 10,40,41。 マリオッテヤ運河は重金属で汚染された水域です42。 この汚染された場所で養殖されたティラピアは、金属汚染の適切な生物指標であると考えられており、人間の健康に潜在的なリスクをもたらします 21,22,23。 家庭排水および産業廃水中の鉛を少なくとも規制レベル以下に効率的に下げることは重要です。 農業資材による重金属の吸着は広く研究されています43。 ニーム (Azadirachta indica) は、魚の捕食者を管理し、多くの細菌性および寄生性の魚の病気を治療する有望な治療用植物です。 鉛やカドミウムなどのさまざまな金属に対する吸着能力があります44、45、46。 原料の植物材料（葉）は収穫され、すぐに、または乾燥および粉砕後に適用されます。 水性ニーム抽出物を調製する簡単な方法は、植物材料を水に浸すことです。 生のニーム葉粉末 (NLP) とその水性抽出物は、動物や魚に対して有害な影響よりもむしろ利点を示します47。 Bhattacharyya と Sharma44 は、バッチ吸着技術を使用して、1.2 g L-1 NLP が 300 mg L-1 の溶液から 96 時間で 93% もの鉛を除去できることを発見しました。

この研究では、さまざまな組織における鉛の生体蓄積の推定と、水生環境の金属汚染を反映する O. niloticus の肝臓、えら、筋肉における酸化ストレスの評価を通じて、魚の健康状態に対する鉛の影響を調査しました。 また、自然に汚染された場所から収集され、実験的に鉛誘発毒性を示した魚の臓器の組織病理学的評価も実施し、鉛毒性の低下におけるインドニームの葉の粉末の水への曝露の潜在的な役割に明示的に言及しました。

地表水と野生のナイル川ティラピアのサンプルは、エジプトのギザにあるマリオッテヤ運河から集められました。この運河は、未処理の家庭廃棄物、農業廃棄物、産業廃棄物の大量投入により、深刻な生物汚染および化学汚染問題に悩まされています42。 3 つの水サンプルを、水面下 30 cm の清潔なガラス瓶 (容量 1 L) に収集しました。 平均体重 200 ± 30 g の合計 10 匹の野生ナイル ティラピアを同じ地域から収集し、アイスボックスに入れて実験室に輸送しました。 魚を解剖して肝臓、えら、筋肉のサンプルを採取しました。 鉛濃度分析は、サンプリング日に水と組織サンプルの一部に対して実施されました。 酸化剤/抗酸化剤バイオマーカー、遺伝毒性、および遺伝子発現を評価するために、組織の一部を -80 °C に保存しました。 もう 1 つは組織病理学的評価に使用されました。

水サンプルを硝酸と混合し、ガラスフィルターで精製し、原子分光光度計 (モデル 3100、パーキンエルマ、ノーウォーク、コネチカット州、米国) を使用して分析しました。 組織サンプルを 105 °C で 12 時間脱水し、マッフル炉内で 550 °C で 16 時間焼成し、酸消化 (HNO3) し、Omar が推奨するドライアッシュ手順を使用して所定の容量まで脱イオン水で希釈しました。他48． 魚組織中の鉛濃度は mg kg-1 で記載されました。

成熟した A. indica の葉は、エジプトの農業研究センターから収集されました。 葉を徹底的に洗浄してほこりや不純物を取り除き、室温および 50 °C のオーブンで 3 日間乾燥させました。 乾燥した葉を粉砕し、ふるいにかけ、ニームの葉の細かい粉末（NLP）を収集しました。 粉末を精製水で洗浄して色素と濁りを除去し、再乾燥し、生体吸着剤としてガラス瓶に保管しました46。 NLP は、ダイレクト キャピラリー カラム TG-5MS および GC-TSQ 質量分析計 (Thermo Fisher Scientific、米国テキサス州オースティン) を使用して分析され、ニームのエタノール抽出物の化学組成が決定されました。 カラムオーブンの温度は、最初は 60 °C に保持され、6 °C min-1 で 250 °C まで上昇し、1 分間保持され、その後 30 °C min-1 で 300 °C まで上昇しました。 インジェクター温度は 270 °C に維持されました。 純粋なヘリウムをキャリアガスとして 1 mL min-1 の定常流量で利用しました。 オートサンプラー AS3000 とスプリット モードの GC を使用して、1 μl の希釈サンプルが 4 分の溶媒遅延で自動的に注入されました。 フルスキャンモードでは、50 ～ 650 の m/z 範囲をカバーする EI 質量スペクトルが 70 eV のイオン化電圧で収集されました。

エジプト、シャルキア県の民間養殖場から、体重 20 ± 2 g、生後 2 か月の雌雄 O. niloticus を合計 150 匹購入しました。 それらを、総水量６０Ｌの水を持つ１５個のガラス水槽（４０×３０×１００ｃｍ）に分配した。 順応から 2 週間後、魚を 5 つのグループに分けました (30 匹の魚/グループ、3 つの反復)。 G1 は、何の処理も行わずに陰性対照として割り当てられました。 グループ (2～5) は、飼育水に溶解した酢酸鉛に 5 mg L-1 (G2 および G3) または 10 mg L-1 (G4 および G5) の濃度で 2 週間曝露されました49。 鉛曝露期間中、すべてのグループは同じ条件下で飼育され、G3 と G5 は 1 g L-1 NLP44 で処理されました (図 1)。 試験の最後に、組織 (肝臓、えら、筋肉) を採取するために、水槽あたり 5 匹の魚を Ictyoclove® (フランス) で安楽死させました。

実験のスキーム。

脂質過酸化は、チオバルビツール酸反応性物質アッセイ (TBARS) 50 を使用してマロンジアルデヒド (MDA) (mM g-1 タンパク質) の量を測定することによって測定されました。 グルタチオン減少 (GSH) (mM g-1 タンパク質) は Ellman51 に従って評価されました。 生成された色の吸光度は、UNICO-UV-2100 分光光度計を使用して測定されました。

DNA 断片化はジフェニルアミンによって感知されました。 形成された青色を、UNICO-UV-2100分光光度計を使用して578nmで定量した。 DNA 断片化のパーセンテージは、DNA 断片化の % = (上清の OD/上清の OD + ペレットの OD) × 10052 として記載されました。

遺伝子発現を測定するために、肝臓、えら、筋肉からの組織サンプルをトリアゾール溶液中に収集しました。 全RNAは、QIAmp RNAミニキット(Qiagen、ドイツ)を製造業者のプロトコールに従って使用して抽出した。 トータル RNA サンプルの濃度と純度は、Nanodrop ND-1000 分光光度計を使用してチェックされました。 各サンプルについて、製造業者の指示に従って、PrimeScript RT 試薬キット (Takara、中国) を利用して cDNA を生成しました。 SYBR Green ベースの PCR を自動サーマルサイクラー (Bio-Rad) で、2 μL cDNA 溶液、12.5 μL SYBR Premix Ex Taq (Takara)、1 μL プライマー (10 μmol L-1) を含む 25 μL の容量でステージングしました。 (表 1)、および 8.5 μL ddH2O。 サイクリング反応は、メーカーの推奨に従って、標準的な 2 ステップ PCR によって完了しました。 実験的な Ct 値をハウスキーピング遺伝子として GAPDH に対して正規化し、対照サンプルと比較して相対的な mRNA 発現を計算しました。 各アッセイには、試験した各 cDNA およびテンプレートなしのネガティブ コントロールの 3 つのサンプルが含まれていました。 コントロールと比較した発現は、2-ΔΔCT 法 53 を使用して評価されました。

野生魚のえら、肝臓、腎臓、脾臓、脳、筋肉、および実験魚の肝臓、えら、筋肉から組織サンプルを収集し、10% 中性ホルマリン緩衝液で固定しました。 次に、固定サンプルをパラフィン包埋法を使用して処理し、ドイツの Leica 2135 ミクロトームを使用して厚さ 3 ～ 4 μm の切片に切片化し、H&E 染色を使用して染色しました。 実験魚の病変の半定量的スコアリングシステムが実行されました。 スコア 0 は病変がないことを示し、1 は軽度の病変 (影響を受けた組織の 1 ～ 25%) を示し、2 は中等度の病変 (影響を受けた組織の 25 ～ 50%) を示し、3 は重篤な病変 (51% ～ 100%) を示しました。影響を受ける組織）。

統計評価は、SPSS バージョン 21 の一元配置分散分析を使用して完了しました。顕微鏡的病変スコアは、クラスカル – ウォリス検定およびマン – ホイットニー U 検定を使用して統計的に分析されました。 病変スコアは箱ひげ図で表示されます。 P 値 < 0.05 は有意なものとしてカウントされました。

施設内動物管理使用委員会 (IACUC) (獣医師 CU 01122022596 - 承認日: 2022 年 1 月 12 日) およびタンタ大学農学部の倫理委員会は、本研究における治療のための実験プロトコールとすべての方法を承認しました。科学目的の動物 (承認番号 2019-2020 年度/セッション 6/2020.01.13)。 すべての実験は、関連するガイドラインおよび規制に従って実行されました。 動物を含む研究に関する当社の報告は、ARRIVE ガイドラインの推奨事項に従っています。 この研究で使用された植物材料は、エジプトのキングサルマン国際大学砂漠農業学部で、機関のガイドラインと法律に従って収集、検査され、植物学的に同定されました（伝票標本番号：Neem/DA-1/2023）。

マリオッテヤ運河から集められた水は高濃度の鉛で汚染されていました (表 2)。 鉛の平均レベルは 0.6 ± 0.21 mg L-1 (P 〜 0.01) で、これは許容限界 (0.05 ppm) よりもはるかに高かった。 鉛の生物蓄積率は、マリオッテヤ運河からの O. niloticus の肝臓、えら、筋肉で大幅に上昇しました。

G2 のすべての組織における脂質過酸化濃度は、対照群と比較して実質的に増加しましたが、G3 の脂質過酸化濃度は対照群の値近くまで大幅に減少しました。 さらに、野生ティラピアのすべての組織は、鉛の濃度が統計的に有意ではなかった鰓を除いて、実験対照およびG2と比較して有意に高いMDA濃度を示した。 1 g L-1 NLP に曝露しても、G5 における高濃度の酢酸鉛の有害な影響は軽減されませんでした (図 2)。

実験用および野生のティラピアの組織における MDA 濃度 (mM g-1 タンパク質)。 固有の上付き文字を持つバーは異なります (P < 0.05)。

G3 の肝臓組織における GSH レベルは、G2 と比較して大幅に増加しましたが、同じグループの他の組織では大きな変化はありませんでした。 しかし、すべての野生組織のGSH含有量は、処理グループ（G2、G3、G4、およびG5）よりも大幅に高く、対照（G1）よりも低かった（図3）。

実験用および野生のティラピアの組織におけるグルタチオン濃度（mM g-1 タンパク質）の低下。 異なる文字のバーは (P < 0.05) で変化します。

G2 のすべての組織における DNA 断片化の割合は、対照群と比較して有意に増加しましたが、G3 の肝臓、えら、筋肉では G2 と比較して有意に減少しました。 1 g L-1 NLP を添加しても、G5 における 10 mg L-1 酢酸鉛の遺伝毒性効果は減少しませんでした。 一方、すべての野生ティラピア組織における DNA 断片化の割合は、対照よりも有意に高かった (図 4)。

実験用および野生のナイルティラピアの組織における DNA 断片化率 (%)。 バーは異なる上付き文字の変化を示しました (P < 0.05)。

ALAD遺伝子は、他の治療群と比較して、G3では肝臓、えら、筋肉でそれぞれ3倍、2倍、1.8倍有意に過剰発現した。 ALAD遺伝子の発現は、対照と比較して、G2、G4、G5、および野生ティラピアのすべての組織サンプルで下方制御されていました（図5）。

さまざまなグループおよび野生ティラピアの ALA-D 遺伝子発現の定量的 RT-PCR。 (a) 対照と比較した、さまざまなグループおよび野生ティラピアの肝臓、えら、筋肉器官における ALA-D 遺伝子発現の評価。 値は平均値 ± SE として表されます。 n = 5。* が付いたバーは P < 0.05 で異なります。 (b) 2% アガロースゲル上の ALA-D および GAPDH (内部対照) 遺伝子の定量的 RT-PCR 産物の電気泳動移動度のトリミングされたゲル。 レーン 1 = G1; レーン 2 = G3; レーン 3 = G2; レーン 4 = G5; レーン 5 = G4; レーン 6 = 野生のティラピア。

マリオッテヤ運河からの魚のサンプルでは、​​さまざまな臓器にさまざまな損傷が見られました。 鰓の顕微鏡検査により、二次鰓薄板の融合を伴う重篤な上皮および粘膜細胞過形成の領域に加えて、二次鰓薄板の先端に動脈瘤、重度の上皮肥大、および一次鰓薄板における大規模な白血球浸潤が明らかになりました（図6a）。 (図6b)。 鰓軟骨では、線維性結合組織被膜に包まれ、好酸球性顆粒細胞 (EGC) と単核細胞に囲まれた、さまざまなサイズの被嚢メタセルカリアを含む寄生虫の侵入がえらで観察されました。 鰓軟骨は変形し、壊死し、断片化していました (図 6c)。 鰓上皮における細菌の集合体である孤立性上皮システィスは、鰓上皮ではまれに観察されました（図6d）。 筋肉の顕微鏡検査では、形態学的外観に基づいて特定されたさまざまな寄生虫の侵入が示されました。 筋束の萎縮と変性とともに、最小限の組織反応を伴う嚢胞性メタセルカリアと筋束（ミクソボルス種）の内側の寄生性嚢胞がありました（図6e）。 さらに、複数の可変サイズの丸い紫色の寄生虫が筋線維の間に観察されました（Ichthyphonus spp.）（図6f）。 肝臓顕微鏡検査では、核濃縮を示す孤立性壊死細胞に加えて、門脈領域におけるEGC浸潤が示されました（図6g）。 ＥＧＣは、肝膵臓におけるいくつかのメラマクロファージの浸潤とともに、肝膵臓の被膜において顕著であった。 脳顕微鏡検査により、血管周囲のリンパ球のカフィングとグリオーシスのびまん性および焦点領域が明らかになりました（図6h）。 また、神経変性および白血球浸潤を伴う髄膜炎も示されました。 腎臓顕微鏡検査により、内腔が狭くなり、核濃縮を示す壊死細胞を伴う尿細管上皮の腫れが明らかになりました（図6i）。 メラマクロファージ、単核細胞、および線維性被膜に囲まれた壊死組織を伴う複数の肉芽腫も観察されました（図6j）。 繊維性カプセルとEGCに囲まれた被嚢メタセルカリアが観察されました（図6k）。 脾臓に関しては、メラマクロファージ中心の活性化が見られました（図6l）。

(a – d) ギル、Oreochromis niloticus。 (a) 二次鰓板先端の板状血管における動脈瘤の存在、上皮過形成、炎症細胞浸潤、および軟骨変性。 (b) 重度の上皮細胞および粘膜細胞過形成、二次鰓板の融合、および炎症細胞浸潤。 (c) 一次鰓板の軟骨における被嚢メタセルカリアの存在。 (d) 単核細胞および好酸球性顆粒細胞を含む重度の炎症性細胞浸潤に加えて、上皮細胞炎の存在。 (e,f) 筋肉。 (e) 筋束の萎縮および変性を伴う、筋束内の寄生性嚢胞（Myxobolus spp.）の存在。 (f) 筋線維間の複数の可変サイズの丸い寄生虫 (Ichthyphonus spp.) の存在 (H&E 染色、×400)。 (g) Oreochromis niloticus の肝臓と (h) 脳。 (g) 門脈領域における好酸球性顆粒細胞浸潤および核濃縮を伴う孤立性肝細胞壊死 (H&E 染色、×400)。 (h) 血管周囲のリンパ球性カフィングおよび広範な神経膠症 (H&E 染色、×200)。 (i – k) 腎臓と (l) Oreochromis niloticus の脾臓。 (i) 腎尿細管上皮の腫れと内腔の狭窄。 (j) 繊細な線維組織とメラノマクロファージに囲まれた肉芽腫。 (k) 好酸球性顆粒細胞に囲まれた被膜下被嚢メタセルカリア (H&E 染色、×400)。 (l) 脾臓におけるメラマクロファージ中心の活性化 (H&E 染色、×200)。

実験研究では、鉛への曝露により魚のえら、肝臓、筋肉に組織病理学的損傷が引き起こされ、その重症度は鉛濃度の上昇とともに悪化した。 対照群の鰓顕微鏡検査では、正常な組織構造が明らかになりましたが（図7a）、G2では、上皮肥大、上皮の隆起、白血球浸潤、および一次鰓板の浮腫が示されました（図7b）。 これらの病変は、水中のニームに曝露された G3 で減少しました（図 7c）。 高濃度の鉛に曝露されたG4では、G5の軽度の浮腫と上皮肥大（図7e）と比較して、重度の浮腫と一次鰓板の上皮および軟骨壊死が記録されました（図7d）。 えらの顕微鏡的病変スコアは、浮腫と白血球浸潤を除き、群間で有意差を示さなかったが、これらはG2よりもG3で有意に低かった（図8）。

(a – e) えら、(f – j) 肝膵臓、および (k – o) Oreochromis niloticus の筋肉。 (a) G1 の正常な組織構造。 (b) G3 における浮腫の減少と比較した、G2 における鰓板の上皮肥大、炎症細胞浸潤、および一次鰓板における浮腫。 (d) G4 における一次鰓板の重度の浮腫および軟骨壊死、(e) G5 における軽度の浮腫および上皮肥大と比較。 (f) G1 の正常な組織構造。 (g) G2 における重度の空胞変性、核濃縮症、肝細胞壊死。(h) G3 では減少しました。 (i) G4 における細胞質内硝子体および肝細胞解離を伴う大量の肝細胞壊死、(j) G5 では軽減されました。 (k) G1 における正常な組織構造。 (l) G2 における筋線維の変性と分離、筋束の萎縮と壊死、およびいくつかの白血球浸潤。 (m) 軽度の浮腫と G3 のいくつかの筋束の崩壊。 (n) G4 の筋束の壊死と喪失。 (o) G5 における筋原線維の分離と空胞化 (H&E 染色、×200)。

病理組織学的スコアの箱ひげ図。 (a – c) 鰓病変スコア。 (d – f) 肝病変スコア。 (g – k) 筋肉病変のスコア。 ボックスは四分位範囲 (IQR) を表します。 中央の太い線は中央値です。 最大値と最小値は、上下の細い水平線で表されます。

肝膵臓顕微鏡検査では、G1では典型的な組織構造が示されましたが（図7f）、G2では重度の空胞変性、核濃縮症、および肝細胞の中等度の壊死が明らかになり（図7g）、G3では減少しました（図7h）。 G4では、膵臓細胞の壊死に加えて、肝細胞壊死、孤立性肝細胞壊死、細胞質内の好酸球性ヒアリン小体、および肝細胞解離の大規模な領域がありました（図7i）。 G5ではより少ない病変が観察されました（図7j）。 肝病変スコアはグループ間で有意な差を示した。 肝壊死および変性は、G2と比較してG3で、G4と比較してG5でかなり減少しましたが、有意ではありませんでした（図8）。

治療グループの筋肉顕微鏡検査では、正常な組織構造を有する G1 よりも多くの病変が示されました (図 7k)。 Ｇ２は、変性、筋線維の分離、筋束の萎縮および壊死、およびいくつかの白血球浸潤を示した（図７Ｌ）。 対照的に、G3 筋肉には軽度の浮腫といくつかの筋束の崩壊がありました (図 7m)。 G4では、筋束の壊死と損失が低用量の場合よりも明らかでした（図7n）。 G5では、筋原線維の分離と空胞化が見られましたが、前のグループよりも軽度でした（図7o）。 変性、壊死、萎縮、および筋肉浮腫の重症度は、対照と比較して、G2 および G4 では鉛曝露によって有意に増加しました。 筋肉壊死、萎縮、および白血球浸潤は、G3 では有意に減少しましたが、G5 では減少しませんでした (図 8)。

生体吸着剤の化学構造は金属の吸着プロセスに影響します。 金属イオンの吸着は、生体吸着剤の反応性官能基による相互作用によって起こります。 ニーム葉抽出物の植物化学成分は、アルカロイド、炭水化物、還元糖、フラボノイド、グリコシド、タンニン、フェノール化合物、およびサポニンです (補足ファイル)。 GC-MS の結果から、38 個の化合物の存在が示されました。 この抽出物ではネペタラクトール (イソカラメンジオール) が RT 9.76 (9.39%) で最も高く、次いで 7-メチル-Z-テトラデセン-1-オール アセテートが RT 10.66 (7.59%)、エタンイミドトエ酸が RT 5.33 (6.92%)、サレロシドが続きました。 RT 15.87 (6.48%)、d-ガラ-1-イド-オクトニックアミド RT 7.05 (6.27%)、レデンオキシド-(II) RT 14.29 (6.01%)、ステビオシド RT 6.77 (5.92%)、カロフィレン酸化物（室温 17.16（4.78%））、1,3,5-トリアジン-2,4-ジアミン（室温 11.75（3.99%））、トリデカンジアル（室温 6.30（3.92%））、およびその他の長鎖化合物（38.73%） 。

汚染の程度を評価するために、工業地域近くの水域およびそのような場所に生息する水生種の重金属の濃度が研究されています54。 マリオッテヤ運河の鉛濃度は、FAO42 が推奨する許容限度を超えていることが判明しました。これは、今回の試験で記録された濃度と同様です。 さまざまな臓器における亜致死濃度の鉛の毒性は、主に ROS の産生の亢進によって媒介され、その後生体分子の酸化と病理学的変化を引き起こします。

私たちが調べた野生ティラピアの臓器における鉛の分布は、肝臓→えら→筋肉の順でした。 最高の鉛濃度（11.08 ± 2.3 mg kg-1）は肝臓で見られましたが、最低は筋肉（4.69 ± 1.2 mg kg-1）で見られました。 対照的に、最も高い鉛濃度は、C. gariepinus、O. niloticus、およびニジマスのえらで検出されました55。 これは、曝露時間の違い、水生生態系の鉛濃度、えらの適応メカニズム、肝臓の生体蓄積性の違いによるものと考えられます。

MDA、GSH、および DNA 断片化は、水生動物における鉛誘発酸化ストレスの貴重なバイオマーカーです 56。 本研究では、鉛曝露後のすべての魚組織における DNA 断片化率と MDA (mM g-1 タンパク質) 濃度が有意に増加しましたが、G3 ではすべての組織で有意に減少しました。 さらに、GSH 濃度は、すべての鉛グループの組織で大幅に減少しましたが、G2 と比較して G3 の肝臓では劇的に増加しました。これは、1 g L-1 NLP が 5 mg L-1 の鉛誘発酸化損傷から魚を保護できるが、そうではないことを示しています。 10 mg L-1 鉛に対して。 我々の結果は、マリオッテヤ・ナイルティラピアのさまざまな組織におけるGSH濃度が、鉛に曝露されたグループよりもかなり高いことを実証した。 これらの結果は、鉛曝露後のラベオ・ロヒタの肝臓とえらにおけるペルオキシダーゼ活性の顕著な増加を指摘したShaukatら19と一致した。 この発見は、フリーラジカル誘発毒性に対するさまざまな組織における自然の防御、適応メカニズム、および抗酸化酵素の代償作用に起因すると考えられます57。 Zhang et al.58は、集中的な酸化ストレスが抗酸化酵素をコードする遺伝子発現を促進および活性化し、酸化損傷によって引き起こされる不均衡を繰り返す可能性があると述べた。

60日間の鉛曝露後のクラリアス・バトラクスの脳ではMDAレベルが上昇し59、コイ、オンコルリンクス・マイキス・ウォルバウム、およびアシペンサー・ベリ・ブラント種でもMDAレベルが上昇し、SOD活性は低下した60。 さらに、淡水魚 O. niloticus の肝臓における 7 日間の鉛曝露後、総 GSH および GSH/GSSG レベルが低下しました 61。 Zhang ら 58 は、金魚 Carassius auratus の肝臓における GSH の適応機構の障害は、GSH 消費量が多いためであり、その結果 GSH/GSSG 比が低下したと考えています。 鉛曝露に関する他の研究では、Clarias gariepinus および O. niloticus の肝臓における GSH、SOD、GST、および CAT レベルの大幅な減少が報告されています62。 鉛は、O. niloticus 肝臓 61,63 および Clarias batrachus 脳 59 の GPX 活性の大幅な上昇を引き起こします。 これらの結果は、鉛がハーバー・ワイスおよびフェントン型メカニズムによる ROS の出力を通じて細胞に酸化的損傷を引き起こし、その後脂質過酸化、タンパク質修飾、および DNA 損傷を誘発する可能性があることを示しています 63。 さらに、MDA の上昇はタンパク質や他の生体分子上のアミノ基と反応して、さまざまな付加物を生成します 64。 これらの付加物には、架橋生成物 65 や、変異原性 66 や発がん性 67 のある DNA 塩基との付加物が含まれます。

ヘム合成の抑制は、鉛の重大な影響の 1 つです。 鉛は、最適な酵素活性に必要なスルフヒドリル（SH）基の結合を通じて ALAD 活性を阻害する 68 か、金属結合位置の亜鉛イオンを取り除き、その後酵素の四次構造を変化させます 69。 今回の解析では、異なる鉛濃度にさらされた野生および実験用ナイルティラピアの肝臓、えら、筋肉でALA-D遺伝子発現が著しく低下した。 これらの結果は、水系鉛曝露が ALA-D 転写の下方制御を引き起こすことを示した Li ら 70 と一致した。 Palaemonetes turcorum の肝臓中の高い鉛濃度は、ALA-D 酵素阻害と相関しています 71。 ブエノスアイレスとラプラタの汚染された水域から収集された、ALA-D 活性が低下した Prochilodus lineatus の肝臓と血液サンプル中に高レベルの鉛が含まれていたことも報告されました 72。 ALA-D は、魚種 73 および淡水無脊椎動物の組織 74 における血中鉛濃度と ALA-D 阻害との間に負の相関関係があるため、鉛曝露の特異的なバイオマーカーと考えられています。

ALA-D 阻害の結果として、δ-ALA が血液中に蓄積し、ROS の生成を刺激し 75、酸化ストレスを引き起こします 76。 さらに、ALA の蓄積による酸化的 DNA 損傷は、ヌクレオシドと DNA の両方のキニーネ部分の効率的なアルキル化剤である 4,5-ジオキソ吉草酸への ALA の酸化を通じて発生します77。 同様に、ALA の蓄積は、DNA 上の亜鉛結合部位との相互作用を介して、ALA 誘発 DNA 損傷の原因となる 8-オキソ-7、8-ジヒドロ-2-デオキシグアノシン、および 5-ヒドロキシル-2-デオキシシチジンの過剰産生を引き起こします78。関連タンパク質プロタミン79。 さらに、ALA は構造的に γ-アミノ酪酸に類似しており、神経系の γ-アミノ酪酸受容体を刺激するため、鉛は神経毒性を誘発します69。 本研究では、さまざまな組織における ALA-D 遺伝子発現の抑制が、環境汚染に関連する主要なバイオマーカーであると考えられました。

魚が金属にさらされると免疫系の機能不全が誘発され、死亡率が上昇する可能性があります80。 Paul et al.81 が示唆しているように、鉛は一般に魚の免疫システムを損ない、感染症に対してより脆弱になります。 9.4 mg L-1 酢酸鉛に 4 日間曝露した魚は、黄色ブドウ球菌による攻撃後の貪食活性と貪食指数の低下、一酸化窒素 (NO) やミエロペルオキシダーゼ (MPO) などの抗菌物質の阻害、体内の重度の損傷を示しました。腸上皮、および TNF-α 転写の下方制御。 今回の研究では、中心部の壊死領域と線維性被膜を有する肉芽腫がさまざまな臓器で観察され、これらが周囲の炎症反応を誘発した。 エジプトのティラピアに肉芽腫形成を引き起こす細菌に関する情報はほとんどありませんが、他の国では広範な細菌感染が報告されています。 肉芽腫形成の多くの原因がティラピアに関係しており、報告されています。 Streptococcus agalactiae は、卵巣と精巣に肉芽腫性炎症を引き起こす可能性があります 82。 シュードモナス属の慢性感染症類上皮および被包された壊死組織の肉芽腫を引き起こします83。 さらに、肉芽腫性炎症はフランシセラ ノアツネンシス亜種と関連しています。 中国の養殖ティラピア（O. niloticus および O. aureus）の orientalis 84。

現在の研究では、鉛は以前に報告されたものと同様のさまざまな損傷をえらに引き起こしました85。 筋束の分離や緻密性の低下などの筋損傷も以前に記録されていました86。 さらに、細胞質封入体、腫れ、水腫変性、壊死などの肝臓病変が通常観察されます87。 鉛の毒性による病理学的影響を軽減するには、水から鉛を回収して毒性影響を軽減できるニーム植物が有力な候補です。 ニームには、水質を向上させる多くの薬理特性があります88,89。 現在の研究では、ニームを水に添加すると、鉛の毒性によって引き起こされるさまざまな臓器の病理学的損傷を軽減できることが示されています。 これは、G3 では非常に明白でしたが、高濃度の鉛に曝露された G5 ではそうではありませんでした。これは、G5 ではニームが鉛によって飽和しているためである可能性があります。 Bhattacharyya と Sharma44 は、バッチ吸着技術を使用して、1.2 g L-1 NLP が 300 mg L-1 の溶液から 96 時間で 93% もの鉛を除去できることを発見しました。 吸収は、pH 2 ～ 7 の範囲で常に向上しましたが、それを超えると金属の析出により吸着が実行できなくなりました。 金属カチオンの吸着は、吸着剤表面の性質、金属カチオンの分布、および系の pH に依存します。 溶液の pH に応じて、吸着剤表面の有機官能基が正または負に帯電することがあります。 活性炭の表面は、酸性炭素 - 酸素表面基のイオン化により、pHzpc (ゼロ点電荷) を超える pH 値で負に帯電し、表面基は金属種に対して強力な静電引力を示します。 GC-M を使用してニームの木抽出物のクロマトグラフィーを分析したところ、抽出物には多くの長鎖有機炭素、脂肪族、芳香族官能基が含まれていることがわかりました。 これらの化合物の特性は今後評価される必要があります。 芳香族化合物は、ヒドロキシル (OH-) やケトン (C=O) などの活性中心基を含み、窒素 (N2)、硫黄 (S)、ケイ素 (Si) などの高い電気陰性度の原子を含みます。 多糖類や炭水化物などの複素環式化合物には、多くの活性中心と電気陰性原子があります。 イオン状態の場合、すべての活性基、電気陰性原子、多糖類化合物、炭水化物、酸素原子は部分的にイオン化を起こし、溶液中のイオン化した鉛元素を吸着することができ、この吸着は物理的吸着であると同時に化学的吸着でもあります90。 芳香族電子がヒドロキシル基、エーテル基、フェニル基を含む基を供与する配位傾向は、対応する脂肪族基の配位傾向よりもはるかに優れています。 芳香族誘導体が配位する傾向が高いのは、その高い電子密度と共役に関与する能力から来ています。 この共役により、生成される金属錯体が軽減されます。 その結果、リグニンはセルロースやヘミセルロースに比べて配位や錯体形成傾向が非常に高いことがわかります。 したがって、NLP による金属の取り込みは、そのより高いリグニン含有量に関連している可能性があります。 さらに、以前の研究では、水生環境のアルカリ性 pH が OH や繊維の炭素質 C-OH などの官能基の解離を増加させ、その結果、生体吸着剤の金属の取り込み（吸着効率）を増加させることがわかっています91。

マリオッテヤ運河から採取された水サンプルと魚の内臓を化学分析したところ、FAOの許容限度を超える高い鉛濃度が示された。 水生環境における鉛への致死未満の慢性曝露は、この場所のナイルティラピアに酸化ストレス、遺伝毒性効果、およびさまざまな病理学的変化をもたらします。 5 ～ 10 mg L-1 の酢酸鉛に曝露された野生ティラピアおよび実験用ティラピアから採取された組織サンプル (えら、肝臓、筋肉) では、脂質過酸化と DNA 酸化の増加、ならびに抗酸化防御システムと DNA 発現レベルの低下が示されました。アラド。 病理学的損傷は鉛濃度と直接相関していた。 1 g L-1 のニーム葉粉末は、静的曝露環境における 5 mg L-1 酢酸鉛の水毒性の酸化ストレスと病理学的損傷を軽減しました。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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筆頭著者は、オープンアクセスへの資金提供について科学技術イノベーション資金庁 (STDF) とエジプト知識銀行 (EKB) に感謝したいと思います。

科学技術イノベーション資金庁 (STDF) がエジプト知識銀行 (EKB) と協力して提供するオープンアクセス資金。

エジプト、ギザのカイロ大学獣医学部水生動物医学科

ナーミーン M. アブエララ & ネハル A. ユニス

キングサルマン国際大学獣医学部、南シナイ、エジプト

ナーミーン・M・アブエララ

カイロ大学獣医学部病理学部、ギザ、12211、エジプト

マルワ・S・ハッタブ

カイロ大学獣医学部生化学および分子生物学部、ギザ、12211、エジプト

フダ・O・アブ・バクル

エジプト、ギザ、ドッキの動物衛生研究所免疫学部

サメ・ヘルミー

スエズ運河大学理学部化学科、イスマイリア、41522、エジプト

アーメド・ヒシャム

中東獣医ワクチン (MEVAC)、エルサリヒヤエルゲデダ、44671、エルシャルキア、エジプト

アーメド・ヒシャム

カフレルシェイク大学農学部動物生産学科、カフル・エル・シェイク、33516、エジプト

マフムード・A・O・ダウッド

環境と持続可能性に関する応用研究センター、カイロのアメリカン大学、カイロ、11835、エジプト

マフムード・A・O・ダウッド

タンタ大学農学部、タンタ、31527、エジプト

モハメド・F・エル・バスイニ

キングサルマン国際大学砂漠農業学部、南シナイ、46618、エジプト

モハメド・F・エル・バスイニ

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すべての著者がこの原稿に等しく貢献しました。

モハメッド・F・エル・バスイニへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

ニューメキシコ州アブエララ、ミシシッピ州ハッタブ、ホーバクル州アブバクル 他ニームの葉の粉末 (Azadirachta indica) は、ナイル ティラピア (Oreochromis niloticus) の鉛毒性によって引き起こされる酸化ストレスと病理学的変化を緩和します。 Sci Rep 13、9170 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36121-4

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受信日: 2023 年 1 月 10 日

受理日: 2023 年 5 月 30 日

公開日: 2023 年 6 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36121-4

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